Născut în Chipping Norton, Oxfordshire, Anglia, este fiul unei profesoare, Joy Marie Palm, şi al unui avocat şi profesor, Wentworth Earl Miller II. Tatăl său, bursier la Rhodes, locuia la Oxford în timpul naşterii actorului. Miller are multe origini; tatăl său este jamaican, englez, german şi evreu, în timp ce mama sa are origini ruse, franceze, olandeze, siriene şi libaneze. Când avea doar un an, familia lui s-a mutat în Park Slope, Brooklyn, New York. Are două surori, Leigh şi Gillian. Şi-a luat licenţa la literatura engleză la Universitatea Princeton. În timpul facultăţii, a cantat în grupul a capella al şcolii, care se numea „The Princeton Tiger Tones”.
Primul sau rol a fost David din Dinotopia, o mini-serie realizata de ABC. Dupa cateva roluri de televiziune minore, a devenit unul dintre  protagonistii binecunoscuti ai filmului Human Stain, interpretand versiunea mai tanara a personajului jucat de Anthony Hopkins. A mai aparut in Buffy, spaima vampirilor intr-un episod numit “Go fish”. Miller a devenit şi mai celebru în anul 2005, când obţine rolul lui Michael Scofield in productia televiziunii Fox Network Prison Break. Aici joacă rolul unui frate iubitor care a creat un plan elaborat pentru a-şi ajuta fratele, Lincoln Burrows (Dominic Purcell), să scape de pedeapsa cu moartea după ce a fost acuzat de o crimă pe care nu a comis-o. Interpretarea sa în acest film i-a adus o nominalizare pentru categoria „Best Actor in a Dramatic Series” la Golden Globes în 2005.